"CT value" : RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)

역 PCR에서 CT 값은 RNA 템플릿에서 생성된 cDNA(complementary DNA) 증폭 과정에서 형광 신호가 미리 정해진 임계값을 넘는 사이클 수를 나타냅니다. RT-PCR은 일반적으로 PCR 증폭 전에 RNA 분자를 상보적인 DNA로 변환하여 유전자 발현 수준을 검출하고 정량화하는 데 사용됩니다.

 

역 PCR에서 CT 값을 결정하는 방법은 다음과 같습니다.

 

 

역전사(Reverse Transcription)

역 PCR의 첫 번째 단계에서는 역전사 효소라는 효소를 사용하여 RNA를 상보적 DNA(cDNA)로 변환합니다. 이 과정을 역전사라고 합니다. 역전사 효소는 RNA를 주형으로 사용하고 표적 RNA 분자에 특이적인 프라이머를 사용하여 단일 가닥 cDNA를 합성합니다.

 

PCR 증폭

cDNA가 생성되면 원하는 cDNA 서열을 표적으로 하는 특정 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 수행합니다. PCR 증폭은 변성, 프라이머 어닐링 및 확장을 포함하는 기존 PCR과 유사한 과정을 따릅니다.

 

형광 검출

역 PCR 동안 증폭된 cDNA에 결합하는 형광 염료 또는 프로브를 사용하여 형광 신호를 생성합니다. 기존의 PCR과 유사하게 cDNA 증폭이 진행됨에 따라 형광 신호가 증가합니다.

 

CT 값 결정

역 PCR의 CT 값은 기존 PCR과 유사하게 형광 신호에 대한 임계 수준을 설정하여 결정됩니다. CT 값은 형광 신호가 임계값을 교차하는 주기 수를 나타냅니다.

 

RNA 정량화: 역 PCR은 일반적으로 샘플에 존재하는 RNA의 양을 측정하여 유전자 발현 수준을 정량화하는 데 사용됩니다. RT-PCR에서 얻은 CT 값은 샘플에 있는 RNA 분자의 초기 양을 간접적으로 측정합니다.

 

임계값 결정

CT 값을 계산하기 위해 형광 신호에 대한 임계값 수준을 설정합니다. 임계값은 일반적으로 신호가 배경 잡음보다 훨씬 높은 증폭 곡선의 지수 위상 내에 배치됩니다. CT 값은 형광 신호가 이 임계값을 교차하는 주기 수에 해당합니다.

 

역관계

기존의 PCR과 유사하게 CT 값과 표적 RNA의 시작 농도 사이에는 역관계가 있습니다. CT 값이 낮을수록 샘플 내 RNA 표적의 초기 농도가 높음을 나타내고 CT 값이 높을수록 초기 농도가 낮음을 나타냅니다.

 

상대적 정량화

RT-PCR에서 얻은 CT 값을 유전자 발현의 상대적 정량화에 사용할 수 있습니다. 표적 유전자의 CT 값을 참조 유전자 또는 대조군 샘플의 CT 값과 비교함으로써 연구원은 다양한 샘플 또는 실험 조건에서 표적 유전자의 상대적인 발현 수준을 평가할 수 있습니다.

 

표준 곡선 방법

CT 값은 유전자 발현의 절대 정량화를 위한 표준 곡선과 함께 사용할 수도 있습니다. 알려진 양의 참조 RNA 또는 DNA 템플릿을 증폭하여 표준 곡선을 생성합니다. 알려진 농도에 대한 표준 샘플의 CT 값을 플로팅하여 알려지지 않은 샘플의 CT 값을 사용하여 초기 RNA 농도를 추정할 수 있습니다.

 

정규화

RNA 입력 및 역전사 효율의 변화를 설명하기 위해 참조 유전자 또는 내부 제어를 사용하여 CT 값을 정규화하는 것이 일반적입니다. 이러한 유전자는 다양한 샘플 및 조건에서 안정적인 발현을 위해 선택되며 CT 값은 대상 유전자 CT 값을 정규화하는 데 사용되어 보다 정확하고 신뢰할 수 있는 비교를 제공합니다.

 

제한 사항

CT 값은 역전사의 효율성, PCR 증폭 및 RNA 템플릿의 품질을 비롯한 다양한 요인에 의해 영향을 받는다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 신뢰할 수 있고 의미 있는 CT 값을 얻으려면 적절한 실험 조건, 적절한 제어 및 검증된 프로토콜의 사용을 보장하는 것이 필수적입니다.

 

역방향 PCR의 CT 값은 게놈 DNA가 아닌 RNA 템플릿에서 파생된 cDNA의 증폭과 관련이 있다는 점에 유의해야 합니다. CT 값은 원래 RNA 샘플에서 표적 RNA 분자의 상대적 존재비에 대한 정보를 제공하여 해당 유전자의 발현 수준을 나타냅니다.

 

역 PCR에서 CT 값의 해석 및 분석은 기존 PCR과 유사한 원리를 따릅니다. 연구원은 유전자 발현 수준을 평가하거나 상대적인 정량화를 수행하거나 비교 유전자 발현 연구를 수행하기 위해 다양한 샘플 또는 조건에서 CT 값을 비교할 수 있습니다. 참조 유전자 또는 내부 제어를 사용한 정규화는 종종 RNA 입력, 역전사 효율 및 PCR 증폭 효율의 변화를 설명하기 위해 사용됩니다.

 

 

전반적으로, 역방향 PCR의 CT 값은 형광 신호가 임계값을 교차하는 사이클 수를 나타내며, 이는 표적 RNA의 상대적 존재비를 나타내고 유전자 발현 수준에 대한 통찰력을 제공합니다.