PCR Analysis - IC (Cy5) Negative Signal

Multiplex PCR Analysis
다중 PCR 분석

다중 PCR은 단일 반응에서 여러 표적 서열을 동시에 증폭시키는 것을 포함합니다.

PCR(중합효소 연쇄 반응) 분석에서는 다양한 형광 염료를 사용하여 DNA 프로브나 프라이머를 라벨링하는 경우가 많으며, 이를 통해 연구자와 user는 특정 DNA 서열의 증폭을 모니터링할 수 있습니다.

 

FAM(플루오레세인)과 JOE(2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인)는 모두 녹색 형광 염료입니다. 

VIC(4,7,2',4',5'-헥사클로로-2-카르복시플루오레세인)는 노란색 형광 염료입니다.

노란색 스펙트럼의 빛을 방출합니다.

HEX(헥사클로로-6-카르복시플루오레세인)는 FAM과 유사한 또 다른 녹색 형광 염료입니다.

이들 염료는 다양한 표적 서열에 특이적인 DNA 프로브 또는 프라이머를 표지하는 데 사용됩니다.

 

Role of Internal Controls
정도관리의 역할 : 내부대조군

PCR 반응의 전반적인 성공을 모니터링하고 PCR 억제와 같은 잠재적인 문제를 식별하기 위해 포함됩니다.

내부 대조군은 표적 서열과 함께 증폭되는 비표적 서열입니다.

표적 신호와 구별하기 위해 다른 형광단으로 라벨이 지정되어 있습니다.

 

IC (Cy5) Negative Signal

 

PCR 분석에서 음성 내부 대조(IC) 신호와  강양성 신호 검출(예: FAM/JOE, VIC, HEX)에 대한 대조 불일치가 나오는 경우가 종종 있습니다. 다양한 경우에 대해 한번 알아보겠습니다.

1]  Sensitivity Differences 감도 차이

라벨링에 사용되는 다양한 형광단(IC의 경우 Cy5, 표적의 경우 FAM/JOE, VIC, HEX)은 억제 물질, 템플릿 품질 또는 반응 조건에 대해 다양한 민감도를 나타낼 수 있습니다.
IC는 억제 요인에 더 민감하여 음성 신호를 생성할 수 있는 반면, 표적 형광단은 영향을 덜 받고 양성 신호를 생성할 수 있습니다.

2]PCR Inhibition Specificity PCR 특이성

시료 내 PCR 억제제는 검출 대상에 비해 내부 대조 증폭에 우선적인 영향을 미칠 수 있습니다.
억제제가 내부 대조군의 증폭을 선택적으로 방해하는 경우 표적 서열은 여전히 ​​효율적으로 증폭되어 표적에 대한 양성 신호와 IC에 대한 음성 신호를 초래할 수 있습니다.

3]Competitive Inhibition 경쟁방해

여러 표적과 내부 대조군이 동시에 증폭되는 다중 PCR에서는 경쟁적 억제가 발생할 수 있습니다.
내부 대조 및 표적 서열은 반응에서 제한된 자원을 두고 경쟁할 수 있습니다.

내부 통제가 억제에 더 민감한 경우 표적 서열을 잃어 음성 IC 신호가 발생할 수 있습니다.

 

4] Primer/Probe Design Issues 프라이머/프로브 설계 문제
검출 표적 프라이머와 프로브가 잘 설계되어 있을 수 있지만 내부 제어 구성 요소가 최적으로 작동하지 않아 표적이 성공적으로 증폭되었음에도 불구하고 IC가 음성 신호를 생성할 수 있습니다.

 

5] Template Quality Variability 템플릿 가변성
내부 컨트롤은 템플릿 품질 문제에 더 취약하여 부정적인 신호가 발생할 수 있습니다.

대조적으로, 덜 영향을 받는 탐지 대상은 여전히 ​​긍정적인 신호를 생성할 수 있습니다.

6] Fluorophore-Specific Factors 형광단 요인
각 형광단은 고유한 특성을 가지며 성능은 pH, 온도, 화학적 환경과 같은 요인의 영향을 받을 수 있습니다.
내부 대조에 사용된 Cy5 형광단에 대해 최적이 아닌 조건은 음성 신호로 이어질 수 있는 반면, 검출 대상에 사용된 다른 형광단은 동일한 조건에서 적절하게 수행될 수 있습니다.

7] Quantification Thresholds 정량 임계값
양성 신호의 검출에는 분석에 대해 설정된 정량화 임계값이 적용될 수 있습니다.
IC 증폭이 발생하더라도 신호 강도가 설정된 양성 임계값 이하로 떨어지면 음성으로 분류되고, 타겟 신호가 임계값을 초과하면 양성 결과로 이어질 수 있습니다.

8] Instrument Calibration Issues 기기 교정 문제
기기가 Cy5 채널에 대해 올바르게 보정되지 않은 경우 신호를 잘못 해석하여 다른 형광단의 신호를 정확하게 감지하면서 IC에 대해 거짓 음성이 발생할 수 있습니다.

 

반응형

 

문제 해결

어닐링 온도, 프라이머 농도, 반응 성분 등 PCR 조건을 최적화하여 전반적인 반응 성능을 향상시키고
PCR 억제가 의심되는 경우 DNA 주형을 희석하여 억제 물질의 농도를 줄여보세요.

샘플에서 잠재적인 억제제를 제거하려면 DNA 정제 방법을 사용하는 것이 좋습니다.

 

필요한 경우 내부 대조를 대상으로 하는 프라이머 및 프로브의 특이성과 효율성, 겔 전기영동 또는 분광광도법과 같은 방법을 사용하여 DNA 템플릿의 품질과 무결성을 확인하는것도 좋습니다.

 

상품화를 쓰고 있는경우는 상관없지만 보통 평가와  장비선택의 문제에 들어가기도합니다.

 

 

데이터

IC값을 신뢰할 수 있는지 확인합니다.

부정적인 IC 신호가 반드시 결과를 무효화하는 것은 아니지만 주의가 필요합니다.