anti-platelet antibody 검출 - 혈액은행 진단면역

검사 원리는 항혈소판 항체가 포함된 환자의 혈청으로 정상 O형 혈소판을 감작시키는 것입니다.

환자의 혈청에 항혈소판 항체가 존재하면 정상 O형 혈소판에 결합합니다.

그런 다음 면역형광과 같은 다양한 방법을 사용하여 이러한 감작을 감지합니다.

대표시약

항혈소판 항체가 함유된 환자 혈청
정상 O형 혈소판
검출을 위한 형광 표지된 2차 항체 - FITC - labeled anti-human immunoglobulin 등

 

검사 방법

감작된 혈소판을 검출하기 위해 간접 면역형광법이 일반적으로 사용됩니다.

이 방법에서는 환자 혈청을 정상 혈소판과 함께 배양하여 항혈소판 항체가 혈소판에 결합하도록 합니다.

그다음 세척 후 인간 면역글로불린에 특이적인 형광 표지 항체를 첨가합니다. 항혈소판 항체가 존재하는 경우 혈소판 결합 항체에 결합하여 현미경에 시각화 되어 형광을 발생시킵니다.

일단 정상인 o형의 혈소판을 처리해야겠죠?

1. 1500RPM으로  PRP를 만들어준뒤 이후 3500RPM으로 PC를 만들어줍니다.

2. Tyodes EDTA-PBS로 3~5회 세척한 뒤 1%PFA-PBS (제조사권장)mL를 넣고 고정시킵니다.

3. 다시 Tyodes EDTA-PBS로 3~5회 세척한 뒤 350RPM으로 10m 원심

이후 Tyodes EDTA-PBS로 재부유시킨 뒤 40~100만mm^되도록 만들어줍니다.

 

전처리된 o형 혈소판이 준비되었다면  plate를 준비시키고  100ul 등 동량 혼합시킵니다

 

전처리된 혈소판과 환자혈청을 동량 혼합시키라는 얘기였습니다.

 

이후 1시간정도 37C 배양시킨 후   Tyodes EDTA-PBS로 3~5회 세척한 뒤 3500RPM으로 원심합니다.

이제 본격적으로  FITC Conjugate를 넣어야 하는데 mouse serum이 아니라 goat anti-human ig가 좋습니다.

 

Conjugatefmf를 다시 설정된 동량으로 주입후 ( 100 : 100 : 100 ) 암실에서 배양합니다. 30m~1h

 

이후  Tyodes EDTA-PBS로 다시 3~5회 세척 후 다시  3500RPM으로 원심합니다.

 

그다음 마지막으로 Glycerol-PBS를 25ul를 넣은 후 부유시켜 슬라이드에 drop한뒤 cover lass를 덮습니다.

 

이때 바로 판독하는것이 아니라 부유되어 있는 혈소판이 가라앉는 시간이 필요하여 1~3시간정도 뒤에 판독합니다.

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꼭 음성대조 혈소판이 같이 있어야합니다.

 

그리고 현미경상 보이는 것은 시약염료에 따라 다른데요.

 

녹색이라면 ANA를 현미경으로 시각화되어 보이는 것 + CBC EDTA 스메어 혈소판 형태 = 양성 으로 보입니다.

( 혈소판 표면의 환상과 점상 )

항혈소판 항체의 검출은 면역성 혈소판 감소증(ITP), 약물 유발성 혈소판 감소증, 신생아 동종면역 혈소판 감소증(NAIT), 자가면역성 혈소판감소증과 같은 질환을 진단하는 데 중요합니다.

 

다회수혈시에도 양성으로 보입니다.

 

요즘은 제조사 권장에 따라 많이 다르므로 참고해주세요.

 

대형검사실이라면 PBS등 형광시약으로 비스무리하게 만들어도 실험은 미미하게 보이실것입니다.